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As leveduras de fissão Srr1 e Skb1 promovem a formação de isocromossomos no centrômero

May 16, 2023

Communications Biology volume 6, Número do artigo: 551 (2023) Citar este artigo

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Rad51 mantém a integridade do genoma, enquanto Rad52 causa recombinação homóloga não canônica, levando a rearranjos cromossômicos grosseiros (GCRs). Aqui descobrimos que a levedura de fissão Srr1/Ber1 e Skb1/PRMT5 promove GCRs nos centrômeros. Análises genéticas e físicas mostram que as mutações srr1 e skb1 reduzem a formação de isocromossomos mediada por repetições invertidas do centrômero. O srr1 aumenta a sensibilidade ao dano do DNA nas células rad51, mas não abole a resposta do ponto de verificação, sugerindo que o Srr1 promove o reparo do DNA independente do Rad51. srr1 e rad52 aditivamente, enquanto skb1 e rad52 reduzem epistaticamente os GCRs. Ao contrário de srr1 ou rad52, skb1 não aumenta a sensibilidade ao dano. Skb1 regula a morfologia celular e o ciclo celular com Slf1 e Pom1, respectivamente, mas nem Slf1 nem Pom1 causam GCRs. A mutação de resíduos conservados no domínio de arginina metiltransferase de Skb1 reduz muito os GCRs. Esses resultados sugerem que, por meio da metilação da arginina, Skb1 forma estruturas de DNA aberrantes levando a GCRs dependentes de Rad52. Este estudo descobriu papéis para Srr1 e Skb1 em GCRs em centrômeros.

Rearranjos cromossômicos grosseiros (GCRs), como translocações, podem ocorrer usando sequências repetitivas que são abundantes e difundidas em genomas eucarióticos1. Em humanos, o número total de sequências repetitivas, incluindo repetições de satélites e elementos transponíveis, representa 54% do genoma2,3. GCRs causam morte celular e distúrbios genéticos, incluindo câncer. Por outro lado, os GCRs podem ser uma força motriz da evolução criando diversidade genômica4. Portanto, os GCRs não são apenas fenômenos patológicos, mas também fisiológicos.

O centrômero que garante a segregação cromossômica adequada contém sequências repetitivas de DNA em muitos eucariotos. Os centrômeros humanos (≥ 3 Mb) contêm satélites α e outros tipos de repetições de satélites, elementos transponíveis e duplicações segmentares5. A orientação das repetições do centrômero, incluindo repetições de ordem superior de satélites α, muda dentro de um centrômero, formando repetições de DNA invertidas. Apesar do importante papel na segregação cromossômica, o centrômero é um ponto crítico para quebra e rearranjo cromossômico6,7,8,9,10. A recombinação entre sequências repetitivas no centrômero forma cromossomos anormais11,12,13. As translocações robertsonianas, uma fusão de dois cromossomos acrocêntricos nos centrômeros ou ao redor deles, são a forma mais frequentemente observada de anormalidade cromossômica em humanos, afetando 1 em cada 1.000 recém-nascidos14. Isocromossomos cujos braços são imagens espelhadas um do outro são comumente encontrados em células cancerígenas15. Isocromossomos de chr21 e chrX causam as síndromes de Down e Turner, respectivamente16,17. Em comparação com centrômeros de mamíferos, os centrômeros de S. pombe da levedura de fissão são curtos (35 ~ 110 kb), mas contêm repetições invertidas de DNA flanqueando uma sequência central não repetitiva18,19. Nesse fungo, os isocromossomos são produzidos a partir de repetições invertidas de DNA no centrômero20,21,22. A menor complexidade da sequência de DNA do centrômero torna a levedura de fissão um excelente sistema para estudar o mecanismo dos GCRs centroméricos.

A recombinação homóloga é necessária para reparar danos prejudiciais ao DNA, como quebras de fita dupla23. Rad51 é o elemento-chave na recombinação homóloga canônica e catalisa a busca de homologia e a troca de cadeias de DNA, formando loops de deslocamento. BRCA1 e BRCA2 de mamíferos facilitam a recombinação dependente de Rad51, e suas mutações aumentam os GCRs e predispõem os portadores ao câncer24,25. A recombinação homóloga mantém a integridade do centrômero. Em mamíferos, a inativação de Rad51 aumenta a recombinação aberrante nos centrômeros9,10,26. Na levedura de fissão, a perda de Rad51 aumenta a formação de isocromossomos nos centrômeros20,21,27. Análises detalhadas usando levedura de fissão mostraram que Rad51 promove preferencialmente uma forma conservativa de recombinação: recombinação non-crossover em centrômeros27,28, suprimindo assim a formação de isocromossomos.

300 cells are counted at each point. Pearson's Chi-square test of the septation index between wild-type and other strains at t = 8 h showed that srr1Δ or skb1Δ did not significantly change the septation index (p > 0.05) but chk1Δ increased it. c Chk1 phosphorylation in response to MMS treatment. Before and after 4 h treatment with 0.01% MMS, extracts were prepared from chk1+ (TNF7555) and chk1-HA+ cells of wild-type, srr1Δ, and skb1Δ (TNF8441, 8799, and 8802) and separated by 8% SDS-PAGE. Chk1-HA was detected by Western blotting using anti-HA antibodies (16B12). Whole proteins were stained using Coomassie brilliant blue. Size markers (Takara, 3454 A, CLEARLY stained protein ladder) are shown on the left. wt, wild-type. Uncropped images are shown in Supplementary Fig 6. d Wild-type and srr1Δ (TNF5369 and 5774) cells were plated onto adenine-limited YE plates, on which ade6– cells form red colonies. e Chromosome loss rates of wild-type, srr1Δ, srr1-W157R, skb1Δ, rad51Δ, srr1-W157R rad51Δ, and skb1Δ rad51Δ strains (TNF5369, 5774, 8308, 5772, 5411, 8344, and 5788). The two-tailed Mann-Whitney test. **p < 0.01; ***p < 0.001. Numerical data underlying b, e are provided in Tables C and D, respectively, in Supplementary Data 1./p> 2 × 109 cells mL−1. 100 μL of the cell suspension was mixed with 5 µL of salmon sperm DNA (10 mg mL−1) and the introducing DNA and incubated at room temperature for 10 min. After adding 260 μL of PEG/LiAc/TE (40% PEG4000, 0.1 M lithium acetate, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA), the tube was further incubated for 30 min with rotation. After adding 43 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO), the tube was incubated at 42 °C for 5 min. Cells were harvested by centrifugation at 503 × g for 30 s, suspended in YE or YE3S media, and plated on non-selective media. After one day of incubation, the cells were replica plated onto a medium supplemented with G418 (Nacalai Tesque, 09380–86) or hygromycin B (Nacalai Tesque, 09287–87) at a final concentration of 100 µg mL−1 or clonNAT (Werner BioAgents, 5.001.000) at 50 µg mL−1 to select the transformants. We did not pick up exceptionally large colonies of rad52 mutants because they can contain an fbh1 mutation62./p> 300 nuclei were counted in each experiment. Three independent experimental values and their means were shown in the graph using GraphPad Prism 9 for MacOS (GraphPad Software, San Diego, CA). Images were processed using ImageJ2 2.9.0 or Adobe Photoshop Elements 2020./p>

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