Desenvolvimento de um RT colorimétrico otimizado

May 17, 2023

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 21424 (2022) Citar este artigo

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A pandemia de coronavírus acentuou a necessidade de testes de diagnóstico molecular. Uma técnica muito utilizada para esse fim é a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) – uma técnica sensível e específica comumente usada como padrão-ouro para diagnósticos moleculares. No entanto, exige pessoal altamente treinado e equipamentos de alta manutenção e é relativamente demorado. Uma alternativa é a técnica de Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP), que não requer purificação de amostras ou equipamentos caros e é semelhante à PCR quando comparada em sensibilidade e especificidade. Neste artigo, desenvolvemos um teste Point-of-Care colorimétrico otimizado de amplificação isotérmica mediada por loop de transcriptase reversa (RT-LAMP) usando um dispositivo portátil para diagnosticar COVID-19. Variáveis ​​como concentração de primers, sulfato de magnésio, betaína, cloridrato de guanidina, Bst e temperatura das reações foram testadas. Também criamos um sistema de controle de qualidade de pipetagem - usando uma combinação de corantes - para evitar falsos negativos devido à falta de amostras adicionadas ao tubo de teste de reação. O óleo mineral foi incorporado na composição das reações RT-LAMP para evitar a evaporação quando uma tampa de aquecimento não está disponível. O teste RT-LAMP final é dez vezes mais sensível quando comparado ao WarmStart Colorimetric Master mix da New England Biolabs com uma sensibilidade de 5 cópias por μL.

Em dezembro de 2019, o mundo testemunhou o resultado de um novo coronavírus, denominado Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, ou SARS-CoV-2. O primeiro caso de infecção por SARS-CoV-2 foi relatado em Wuhan, na China, e logo se espalhou por todo o globo, sendo notificado como uma nova pandemia em março de 20201. O surgimento da pandemia revelou a necessidade global de biologia molecular testes para identificar, isolar e tratar pessoas infectadas como forma de controlar a propagação da doença.

A Reação em Cadeia da Polimerase com Transcriptase Reversa (RT-PCR)2 é comumente conhecida como a técnica padrão-ouro para testes moleculares de vírus de RNA, como o SARS-CoV-2. A RT-PCR é uma técnica com alta sensibilidade e especificidade, mas requer equipamentos de alto custo e alta manutenção, extensas etapas de purificação de amostras e pessoal altamente treinado. Com o rápido aumento de pessoas infectadas, ficou evidente a falta de reagentes, insumos, pessoal e equipamentos para testes moleculares, e o mundo vivenciou escassez de recursos laboratoriais para atender a demanda.

A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) foi descrita pela primeira vez por Notomi e seus colegas em 20003 como uma técnica de amplificação de ácido nucleico com alta especificidade e eficiência, capaz de ser realizada em condições isotérmicas. Ele usa uma polimerase de DNA de deslocamento de fita (privada de atividade de exonuclease 5' → 3') e um conjunto de dois a três pares de primers projetados para criar loops no DNA de fita simples sintetizado. Cada vez que a polimerase inicia uma nova amplificação, ela libera a fita de DNA previamente pareada, que forma uma estrutura em loop que contém novos sítios de ligação para a polimerase, criando assim uma amplificação autopropagada. Os produtos finais da reação são estruturas semelhantes a couve-flor com múltiplos loops formados por recozimento entre repetições alternadamente invertidas do alvo3. Assim como na PCR, as reações LAMP também podem ser acopladas a uma enzima transcriptase reversa para realizar a amplificação de moléculas de RNA.

O alto grau de síntese de DNA que ocorre nas reações LAMP permite a detecção visual de uma reação positiva. Sempre que a DNA polimerase incorpora um dNTP na fita de DNA recém-sintetizada, ela libera um pirofosfato e uma molécula de próton como subproduto. O pirofosfato, na presença de íons Mg2+, precipita como pirofosfato de magnésio alterando a turbidez da reação. O próton liberado diminui o pH da reação, o que pode ser detectado pelo uso de um corante colorimétrico sensível ao pH, como o vermelho de fenol e o azul de bromotimol4,5.